Microscopie optique non linéaire et CARS

D’habitude, la microscopie optique est utilisée principalement pour les applications d’imagerie à résolution spatiale latérale, la sélection tridimensionnelle et l’obtention de forts contrastes pour caractériser les spécimens. Cela a donné lieu à la conception de nombreux types de microscope linéaires. Si la microscopie confocale par fluorescence remplie ces trois fonctions, elle nécessite souvent l’ajout de fluorophores exogènes dans le cas des systèmes d’imagerie biologique. En effet, certains colorants et marqueurs fluorescents perturbent l’évolution naturelle du système biologique, rendant ambiguës les observations ou tuant carrément le spécimen. De plus, la microscopie par fluorescence cause parfois le blanchissement des fluorophores, ce qui endommage les cellules. La mirospectroscopie Raman et la microscopie infrarouge permettent d’obtenir un contraste en sondant le spectre de vibration des molécules pour obtenir la sélectivité chimique. Malheureusement, la microscopie infrarouge offre une mauvaise résolution en raison des longueurs d’onde utilisées.

En outre, l’absorption d’eau crée un problème dans de nombreux échantillons biologiques. Pour sa part, la microspectroscopie Raman utilise d’habitude un signal très faible (la plupart des molécules ont une petite coupe transversale Raman) qui nécessite une longue intégration ou de fortes intensités laser. Or, ces fortes intensités créent un fort signal autofluorescent d’arrière-plan qui réduit le contraste et endommage le tissu. L’emploi des procédés optiques non linéaires de concert avec un microscope confocal résout ces difficultés.

Le premier avantage de la microscopie optique non linéaire réside dans l’amélioration de la résolution spatiale. Les procédés non linéaires se fondent sur l’emploi de fortes intensités pour générer un signal appréciable. Ces intensités sont produites par une forte concentration de la lumière d’arrivée au moyen d’objectifs numériques à grande ouverture. Le volume d’excitation effectif qui génère le signal non linéaire est inférieur à celui du signal linéaire, en raison de la nécessité d’utiliser une forte intensité (inférieure selon un facteur propre aux processus de deuxième ordre et à ceux de troisième ordre). Étant donné que le signal est produit seulement à partir du volume focal, on dispose ainsi d’une façon naturelle d’obtenir des sections tridimensionnelles sans l’aide de la géométrie confocale.

Le deuxième avantage de la microscopie optique non linéaire tient au fait que la longueur d’onde d’excitation peut être supérieure à celle obtenue avec la microscopie linéaire. Même si son utilisation réduit un peu les avantages de la résolution spatiale améliorée, la technique non linéaire offre plusieurs avantages pour l’examen des médias condensés. Ainsi, la lumière proche infrarouge permet de réduire l’absorption des impulsions d’excitation dans le solvant et d’obtenir des images des spécimens intégrés dans la matière condensée. Cette propriété est utile pour obtenir des images de cellules vivantes in vivo et de tissus. Le taux moindre d’absorption réduit en outre la quantité d’énergie déposée dans l’échantillon et, partant, les dommages causés à l’échantillon.

Un autre avantage de la microscopie CARS s’explique par la possibilité d’obtenir une spécificité chimique sans l’ajout de fluorophores exogènes. Cela est rendu possible par l’utilisation de niveaux d’énergie résonants dans les molécules étudiées afin d’améliorer considérablement le signal de sortie voulu. Éviter l’emploi de marqueurs fluorescents rend possible l’étude in vivo et in vitro de cellules vivantes sans perturber les processus cellulaires naturels.

Le quatrième et dernier avantage découle de la faible puissance moyenne requise pour les impulsions laser ultrarapides. Les champs laser ultrarapide sont arrivés à maturité et il existe maintenant des dispositifs accordables selon une vaste plage de fréquences, d’où la possibilité de générer d’importants signaux non linéaires avec une faible puissance moyenne. Cela évite le problème de dommage cellulaire inhérent à la microscopie linéaire (et le blanchiment qu’elle provoque). Qui plus est, grâce au dépôt d’énergie moindre dans l’échantillon, le système souffre moins, en général, des inconvénients de l’excitation (comme la chaleur).